La Proteómica Visual Profunda define

Nature Biotechnology volumen 40, páginas 1231–1240 (2022) Citar este artículo

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A pesar de la disponibilidad de métodos basados ​​en imágenes y espectrometría de masas para la proteómica espacial, un desafío clave sigue siendo conectar imágenes con mediciones de abundancia de proteínas de resolución de una sola célula. Aquí, presentamos Deep Visual Proteomics (DVP), que combina el análisis de imágenes de fenotipos celulares impulsado por inteligencia artificial con microdisección láser automatizada de una sola célula o un solo núcleo y espectrometría de masas de ultra alta sensibilidad. DVP vincula la abundancia de proteínas con fenotipos celulares o subcelulares complejos al tiempo que preserva el contexto espacial. Al extirpar individualmente los núcleos del cultivo celular, clasificamos distintos estados celulares con perfiles proteómicos definidos por proteínas conocidas y no caracterizadas. En un tejido de melanoma primario archivado, DVP identificó cambios en el proteoma resueltos espacialmente a medida que los melanocitos normales hacen la transición a un melanoma completamente invasivo, lo que revela vías que cambian de manera espacial a medida que el cáncer progresa, como la desregulación del empalme del ARNm en el crecimiento vertical metastásico que coincide con la reducción de la señalización del interferón y presentación de antígenos. La capacidad de DVP para retener información proteómica espacial precisa en el contexto del tejido tiene implicaciones para el perfil molecular de muestras clínicas.

La versatilidad, la resolución y la naturaleza multimodal de la microscopía moderna ofrecen imágenes cada vez más detalladas de la heterogeneidad unicelular y la organización de los tejidos1. En la actualidad, generalmente se apunta a un subconjunto predefinido de proteínas, muy por debajo de la complejidad real del proteoma. Aprovechando una sensibilidad sustancialmente mayor en tecnología basada en espectrometría de masas (MS), nos propusimos permitir el análisis de proteomas dentro de su contexto subcelular nativo para explorar su contribución a la salud y la enfermedad. Combinamos imágenes de resolución submicrónica, análisis de imágenes para el fenotipado de una sola célula basado en inteligencia artificial (IA) y aislamiento con un flujo de trabajo de proteómica ultrasensible2 (Fig. 1). Los desafíos clave resultaron ser la definición precisa de los límites de una sola célula y las clases de células, así como la transferencia de las características definidas automáticamente a muestras proteómicas, listas para el análisis. Con este fin, presentamos el software 'BIAS' (software de análisis de imágenes biológicas), que coordina los microscopios de barrido y de microdisección láser (LMD). Esto combina a la perfección imágenes ricas en datos de cultivos celulares o tejidos de biobanco archivados (fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE)) con segmentación celular basada en aprendizaje profundo e identificación basada en aprendizaje automático de tipos y estados de células. Los objetos de interés celulares o subcelulares son seleccionados por la IA sola o después de recibir instrucciones antes de someterse a LMD automatizado y perfiles proteómicos. Los datos generados por DVP se pueden extraer para descubrir firmas de proteínas que brindan información molecular sobre la variación del proteoma a nivel fenotípico mientras se conserva la información espacial completa.

DVP combina imágenes de alta resolución, análisis de imágenes guiado por IA para la clasificación y el aislamiento de células individuales con un flujo de trabajo de proteómica ultrasensible2. DVP vincula imágenes ricas en datos de cultivos celulares o tejidos de biobancos de pacientes archivados con segmentación celular basada en aprendizaje profundo e identificación basada en aprendizaje automático de tipos y estados de células. Los objetos de interés celulares o subcelulares clasificados por IA (no) supervisados ​​se someten a perfiles proteómicos automatizados basados ​​en LMD y MS. El análisis posterior de datos bioinformáticos permite que la extracción de datos descubra firmas de proteínas, proporcionando información molecular sobre la variación del proteoma en los estados de salud y enfermedad a nivel de células individuales. tSNE, incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t.

Los aspectos relacionados con la microscopía del flujo de trabajo de DVP se basan en imágenes de diapositivas completas de alta resolución, aprendizaje automático (ML) y aprendizaje profundo (DL) para el análisis de imágenes.

En primer lugar, utilizamos microscopía de barrido para obtener imágenes de portaobjetos completos de alta resolución y desarrollamos un paquete de software para el análisis integrador de imágenes denominado 'BIAS' (Métodos). BIAS procesa múltiples formatos de archivo de imagen de microscopía bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D), y es compatible con los principales proveedores de microscopios y formatos de datos. Combina preprocesamiento de imágenes, segmentación de imágenes basada en DL, extracción de características y clasificación de fenotipos basada en ML. Sobre la base de un algoritmo reciente basado en DL para la segmentación del citoplasma y el núcleo3, llevamos a cabo varias optimizaciones para implementar algoritmos de preprocesamiento para mantener imágenes de alta calidad en grandes conjuntos de datos de imágenes. Los métodos DL requieren grandes conjuntos de datos de entrenamiento, lo cual es un desafío considerable debido al tamaño limitado de los datos de entrenamiento de alta calidad4. Para abordar este desafío, utilizamos nucleAIzer3 y aplicamos la transferencia de estilo de imagen específica del proyecto para sintetizar imágenes de microscopía artificial que se asemejan a imágenes reales. Este enfoque es inherentemente adaptable a diferentes escenarios biológicos, como nuevos tipos de células y tejidos o técnicas de tinción5. Entrenamos una red neuronal profunda con estas imágenes sintéticas para la segmentación específica del compartimento celular de interés (por ejemplo, núcleo o citoplasma; Fig. 2a). Lo comparamos con dos enfoques de DL líderes, unet4nuclei6 y Cellpose7, y un método basado en el umbral adaptativo y basado en la división de objetos ampliamente utilizado8. Nuestros algoritmos de segmentación de células y núcleos de cultivos celulares y tejidos mostraron la mayor precisión (Fig. 2b, Datos extendidos Fig. 1a, Tabla 1 y Tabla complementaria 1). Nuestros resultados de evaluación comparativa actuales están respaldados por un estudio anterior3 en el que realizamos una comparación exhaustiva con métodos y software adicionales (por ejemplo, ilastik9, en un gran conjunto heterogéneo de imágenes de microscopía). Para el descubrimiento de fenotipos celulares interactivos, BIAS realiza la extracción de características fenotípicas, teniendo en cuenta la morfología y las características del vecindario basadas en ML supervisado y no supervisado (datos extendidos, figura 1b y métodos). La clasificación fenotípica basada en características se combina fácilmente con el nivel de expresión de biomarcadores de la tinción de anticuerpos para una clasificación celular precisa. ML se ha utilizado anteriormente para el análisis de imágenes y la selección de células, pero no se ha combinado con proteómica imparcial10. Además, ampliamos BIAS con una interfaz de Python; por lo tanto, el acceso y la manipulación de datos también es posible utilizando las funciones estándar de Python de forma genérica, incluida la integración de paquetes de código abierto y algoritmos personalizados.

a, Núcleo impulsado por IA y segmentación del citoplasma de células y tejidos cancerosos y de apariencia normal usando BIAS. b, Evaluamos la precisión de su enfoque de segmentación utilizando la métrica F1 y comparamos los resultados con tres métodos adicionales: M1 es unet4nuclei6, M2 es CellProfiler8 y M3 es Cellpose7, mientras que OUR se refiere a nucleAIzer3. Las barras muestran las puntuaciones medias de F1 con sem; n = 10 imágenes independientes para tejido de melanoma y células (U2OS), y n = 20 para tejido de glándulas salivales. Representación visual de los resultados de la segmentación: las áreas verdes corresponden a verdaderos positivos, las azules a falsos positivos y las rojas a falsos negativos. c, BIAS sirve como interfaz entre el microscopio de barrido y LMD, lo que permite transferencias de contornos celulares de alta precisión entre los microscopios. Ilustración de desplazamiento de corte con respecto al objeto de interés y búsqueda de ruta óptima. d, Ilustración práctica de las funciones en el panel superior. e, Tinción de inmunofluorescencia del epitelio de la trompa de Falopio humano con anticuerpos FOXJ1 y EpCAM, detectando células ciliadas y epiteliales, respectivamente. Panel izquierdo: Células ciliadas (FOXJ1 positivas) y secretoras (FOXJ1 negativas). Panel derecho: Clasificación celular basada en la intensidad de FOXJ1. Clase 1 (FOXJ1-positivo) y clase 2 (FOXJ1-negativo); factor de magnificación = ×387. f, PCA de proteomas celulares FOXJ1 positivos y FOXJ1 negativos. g, Mapa de calor de marcadores proteicos conocidos para células secretoras y ciliadas. Los niveles de proteína tienen una puntuación z. Los asteriscos representan datos imputados. La lista de marcadores se derivó del proyecto Human Protein Atlas20 y se basó en la extracción de literatura. h, diagrama de volcán de la comparación proteómica por pares entre células positivas para FOXJ1 y negativas para FOXJ1. Las proteínas marcadoras específicas del tipo de célula se resaltan en verde y turquesa, y el negro representa posibles proteínas marcadoras novedosas. Las proteínas específicas del tipo de célula enriquecidas significativas se muestran sobre las líneas negras (prueba t de dos caras, FDR < 0,05, s0 = 0,1, n = 4 réplicas biológicas).

Para extraer físicamente las características celulares descubiertas con BIAS, desarrollamos una interfaz entre los microscopios de barrido y LMD (actualmente Zeiss PALM MicroBeam y Leica LMD6 y LMD7) (Fig. 2c). BIAS transfiere los contornos de las células entre los microscopios, conservando la máxima precisión. LMD tiene una precisión teórica de 70 nm usando un objetivo ×150, pero, en la práctica, alcanzamos los 200 nm. Después de la optimización, el LMD7 puede extirpar de forma autónoma 1250 contornos de alta resolución por hora, lo que equivale a entre 50 y 100 células por muestra (Métodos). Para evitar posibles daños inducidos por láser en las membranas celulares, extirpamos los contornos con un desplazamiento (Fig. 2c, d y Videos complementarios 1 y 2).

Los métodos LMD actuales preservan el contexto espacial, pero se limitan principalmente a fenotipos observables por el ojo humano y requieren una selección manual de células, lo que a menudo resulta en la mezcla de diferentes tipos de células, lo que limita el rendimiento y el descubrimiento de novo11.

Para explorar la sensibilidad, la especificidad y la solidez de nuestro flujo de trabajo de DVP, obtuvimos tejido de trompa de Falopio humano normal y separamos las células ciliadas de las secretoras (los dos tipos de células principales del epitelio de la trompa de Falopio12) utilizando el factor de transcripción específico del linaje celular FOXJ1, un regulador maestro de la función de los cilios, y midió sus proteomas (Fig. 2e-h, Datos extendidos Fig. 1c-f y Tabla complementaria 2). Solo detectamos FOXJ1 (células ciliadas) en células teñidas con FOXJ1 (Fig. 2e, g), junto con más de otras 5000 proteínas cuantificadas con excelentes correlaciones de réplicas biológicas (Datos extendidos Fig. 1d, e). El análisis bioinformático de las diferencias en la abundancia de proteínas reflejó las características biológicas de los distintos tipos de células. (Fig. 2f–h y datos extendidos Fig. 1c–f). Esto fue impulsado por marcadores de proteínas conocidos de células ciliadas y se expandió a proteínas que aún no están asociadas funcionalmente con estos tipos de células. Usamos el epitelio de la trompa de Falopio como ejemplo para resaltar la importancia de la combinación de tinción de tejido basada en anticuerpos y proteómica cuantitativa e imparcial. Tales comparaciones de tipos de células in vivo permitirán el descubrimiento de marcadores de tipo y estado celular y proporcionarán información imparcial para comprender los estados de enfermedad a nivel de proteoma global. Es de destacar que el cáncer de ovario seroso de alto grado se origina en el epitelio de las trompas de Falopio, y nuestro método ahora se puede aplicar para estudiar el inicio temprano de la enfermedad sin mezclar tipos de células no relacionadas13.

Aplicamos nuestro flujo de trabajo a una línea celular de cáncer imperturbable para determinar si DVP puede caracterizar la heterogeneidad funcional entre células aparentemente similares (indicador de ciclo celular basado en ubiquitinación fluorescente (FUCCI) células U2OS14). Después de la segmentación basada en DL para la detección de núcleos y membranas celulares, aislamos de 80 a 100 células individuales o de 250 a 300 núcleos por fenotipo (Figs. 2c, d y 3a, b). El análisis de pequeñas cantidades de células por MS ha sido un objetivo de larga data, frenado por formidables desafíos analíticos en la transferencia, procesamiento y análisis de muestras diminutas15, que abordamos a su vez. Procesamos las muestras utilizando nuestro flujo de trabajo recientemente desarrollado para la entrada de muestras ultrabajas2,16, que omite cualquier paso de transferencia de muestras y garantiza la desreticulación en volúmenes muy bajos (Métodos). Descubrimos que las muestras podían analizarse directamente de 384 pozos sin ninguna transferencia o limpieza adicional de muestras. Para las mediciones de MS, empleamos un método de adquisición independiente de los datos utilizando acumulación paralela-fragmentación en serie con una dimensión de movilidad de iones adicional y recuperación de iones de fragmento óptimo (diaPASEF) en un espectrómetro de masas recientemente desarrollado2,17. Las réplicas de proteomas de células y núcleos demostraron una alta reproducibilidad cuantitativa (Pearson r = 0,96), y los proteomas de células enteras diferían de los de los núcleos solos, como se esperaba de los experimentos de proteómica subcelular basados ​​en la separación bioquímica18 (Datos extendidos Fig. 2a,b). En el análisis de enriquecimiento bioinformático, términos como membrana plasmática, mitocondria, nucleosomas y complejos de factores de transcripción fueron muy significativos (tasa de descubrimiento falso (FDR) <10−5) (Fig. 3c).

a, Segmentación de células completas y núcleos en células U2OS teñidas con BIAS de ADN (DAPI). Barra de escala, 20 μm b, LMD automatizado de células completas y núcleos en placas de 384 pocillos. Las imágenes muestran pozos después de la recolección. c, Niveles relativos de proteína (eje x) de los principales compartimentos celulares entre células enteras (n = 3 réplicas biológicas) y núcleos (n = 3 réplicas biológicas) proteomas específicos. El eje y muestra la densidad de puntos. d, Izquierda: flujos de trabajo conceptuales del modelo de búsqueda de fenotipos de BIAS para la clasificación de fenotipos celulares basada en ML. Derecha: resultados de la clasificación basada en ML no supervisada de seis clases distintas de núcleos U2OS en función de las características morfológicas y la intensidad de la tinción del ADN. Los colores representan clases. Barra de escala, 20 μm. e, características fenotípicas utilizadas por ML para definir seis clases de núcleos distintos. Los gráficos de radar muestran los niveles relativos con puntuación z de las características morfológicas (área nuclear, perímetro, solidez y factor de forma) y la intensidad de la tinción del ADN (señal DAPI total). f, Imágenes de ejemplo de núcleos de las seis clases identificadas por ML. El color azul muestra la intensidad de tinción de ADN y el color rojo muestra la intensidad de tinción de EdU para identificar las células que se replican. Los núcleos representados están ampliados para su visualización y no reflejan los tamaños reales. g, PCA de cinco clases de interfase basadas en 3653 grupos de proteínas después del filtrado de datos. Las réplicas de clases (n = 3 réplicas biológicas) se destacan mediante elipses con un intervalo de confianza del 95 %. h, Análisis de enriquecimiento de proteínas reguladas entre las cinco clases de núcleos. Proteínas significativas (515 ANOVA significativo, FDR < 0,05, s0 = 0,1) se compararon con el conjunto de proteínas sin cambios según el proceso biológico de ontología génica (GOBP), las vías de Reactoma, así como las anotaciones del ciclo celular y del cáncer derivadas del Human Protein Atlas ( HPA)20. Se utilizó una prueba exacta de Fisher con un FDR de Benjamini-Hochberg de 0,05 (Tabla complementaria 3). i, Agrupación jerárquica no supervisada de los 515 grupos de proteínas significativos de ANOVA (Tabla complementaria 4). Las proteínas reguladas por el ciclo celular informadas por HPA se muestran en la barra inferior. Las clases de núcleos (n = 3 réplicas biológicas) se muestran en la barra de fila. C1-C4 muestran grupos regulados al alza en las diferentes clases de núcleos. j, Análisis de red de vías enriquecidas para grupos de proteínas C1–C4. El análisis de enriquecimiento de rutas se realizó con el paquete ClusterProfiler R36. RE, retículo endoplásmico; PC, componente principal.

Para abordar si las diferencias morfológicas entre los núcleos también se reflejan en sus proteomas, utilizamos un modelo de buscador de fenotipo no supervisado para identificar grupos de núcleos morfológicamente distintos en función del área nuclear, el perímetro, el factor de forma, la solidez y la intensidad de tinción del ADN (Fig. 3d). ML encontró tres clases de núcleos primarios (27–37% cada uno) y también identificó tres raros (2–4% cada uno) (Datos extendidos Fig. 2c). Las seis clases de núcleos distintas resultantes tenían diferencias visibles en tamaño y forma, con la clase 1 representando estados mitóticos y las cinco clases restantes representando la interfase con una ponderación de características variable (Fig. 3e, f). Nos enfocamos en esas cinco clases de núcleos de origen desconocido para su posterior análisis. En el análisis de componentes principales (PCA), las réplicas de los respectivos proteomas se agruparon estrechamente y las clases más frecuentes (2, 3 y 5) se agruparon (Fig. 3g). Para verificar y cuantificar esta observación, comparamos cada proteoma de clase celular con un proteoma de todos los núcleos 'mixtos' en un campo de visión. Esto reveló que las clases de células más raras tenían el mayor número de proteínas expresadas diferencialmente en comparación con los proteomas 'a granel' no clasificados (Datos extendidos Fig. 2d, e). Luego preguntamos si las diferencias proteómicas en las cinco clases de núcleos sugerían alguna diferencia funcional entre los estados de interfase (Fig. 3d, f). Las 515 proteínas expresadas de forma significativamente diferencial en todas las clases se enriquecieron en proteínas nucleares y relacionadas con el ciclo celular (por ejemplo, 'cambio de orígenes a un estado post-replicativo' y 'condensación de cromosomas de profase'), lo que sugiere que el ciclo celular es funcional. impulsor de la separación (Fig. 3h-j, Datos extendidos Fig. 2f y Tablas complementarias 3 y 4). Al comparar nuestros datos con un conjunto de datos de imágenes de una sola célula de proteínas reguladas por el ciclo celular19, encontramos un enriquecimiento significativo en nuestras proteínas reguladas (FDR < 10−6). El área nuclear, una de las características impulsoras entre las diferentes clases identificadas, aumentó durante la interfase de las células G1 a S/G2 (Fig. 3e y Datos extendidos Fig. 3a–c), lo que respalda aún más la importancia del ciclo celular en la definición de los núcleos. clases

Nuestros proteomas de tipo unicelular descubrieron varias proteínas no caracterizadas, lo que presenta una oportunidad para asociarlas con una posible función celular. Centrándose en C11orf98, C7orf50, C1orf112 y C19orf53, que permanecieron después del filtrado de datos (ANOVA P <0.05), mostró patrones de expresión específicos de clase (Datos extendidos Fig. 3d). C7orf50 se expresó más altamente en los nucléolos de las clases 2, 4 y 3, que mostraron características específicas de S / G2 (Fig. 3f y Datos extendidos Fig. 3d, e), lo que sugiere que su expresión está regulada por el ciclo celular. De hecho, confirmamos niveles más altos de C7orf50 en G1/S y S/G2 en comparación con las células de la fase G1 (Datos extendidos Fig. 3e). Como las proteínas reguladas por el ciclo celular pueden estar asociadas con el pronóstico del cáncer19, investigamos C7orf50 en el atlas de patología humana20 donde la alta expresión se asoció con resultados favorables en el cáncer de páncreas (Datos extendidos Fig. 3g; P < 0.001). El análisis bioinformático reveló interacción, coexpresión y coubicación con la proteína LYAR ('proteína nucleolar reguladora del crecimiento celular'), lo que sugiere un vínculo funcional con la proliferación celular (datos extendidos Fig. 3f, h).

La clase 6 mostró una firma proteómica intrigante independiente de los marcadores del ciclo celular conocidos (Fig. 3i, j). Estos raros núcleos en forma de frijol mostraron una regulación al alza de proteínas de adhesión celular y del citoesqueleto específicas (por ejemplo, VIM, TUBB, ACTB e ITGB1), lo que sugiere que estas firmas derivan de células migratorias que experimentan deformación nuclear, lo que sugiere una invasión celular21,22. Tenga en cuenta que clasificamos los núcleos a partir de imágenes 2D, pero LMD los aísla en 3D. Por lo tanto, las muestras también sondean la relocalización de proteínas impulsada por la morfología alrededor del núcleo, como lo ejemplifican los núcleos de clase 6. Del mismo modo, la escisión de los núcleos captura el tráfico de proteínas hacia y desde el citosol hasta cierto punto.

Estos experimentos de cultivo celular establecen que DVP correlaciona fenotipos celulares, heterogeneidad y dinámica con el nivel de proteoma de manera imparcial para fenotipos comunes y raros.

Miles de millones de muestras de pacientes se recolectan de forma rutinaria durante el diagnóstico y se almacenan en los archivos de los departamentos de patología de todo el mundo23. La caracterización proteómica precisa de células individuales en su contexto espacial y subcelular a partir de portaobjetos de tejido podría tener un efecto clínico tremendo, complementando el campo emergente de la patología digital24. Seleccionamos tejido embebido en parafina archivado de un carcinoma de células acínicas de glándulas salivales, una neoplasia maligna rara y poco estudiada de las células secretoras epiteliales de las glándulas salivales. Desarrollamos un protocolo de tinción inmunohistoquímica (IHC) en portaobjetos de membrana de vidrio para LMD y teñimos el tejido para EpCAM para delinear los límites celulares para la segmentación y extracción de características por BIAS (Métodos). Estas regiones de apariencia histológicamente normal estaban compuestas principalmente por células acinares, ductales y mioepiteliales, mientras que el componente de carcinoma tenía células tumorales predominantemente uniformes con núcleos redondos y abundante citoplasma basófilo (Fig. 4a,b).

a, tinción IHC de un carcinoma de células acinares de la glándula salival utilizando la proteína de adhesión celular EpCAM. b, Regiones representativas de tejido de apariencia normal (paneles superiores I y II) y carcinoma de células acinares (paneles inferiores III y IV) de a. c, Flujo de trabajo de DVP aplicado al tejido de carcinoma de células acinares. Detección de células individuales basada en DL de células de apariencia normal (verde) y neoplásicas (magenta) positivas para EpCAM. Clasificación celular basada en características fenotípicas (factor de forma, área, solidez, perímetro e intensidad EpCAM). d, correlaciones de proteoma de réplicas de regiones de apariencia normal (normal, n = 6) o de cáncer (cáncer, n = 9). e, Gráfica de volcán de comparación proteómica por pares entre tejido normal y canceroso. Las proteínas significativas de la prueba t (prueba t bilateral, FDR < 0,05, s0 = 0,1, n = 6 réplicas biológicas para normal y n = 9 para cáncer) se resaltan con líneas negras. Las proteínas más expresadas en el tejido normal se resaltan en verde a la izquierda del volcán, incluidos los marcadores de células acinares conocidos (AMY1A, CA6 y PIP). Las proteínas más expresadas en el carcinoma de células acinares están a la derecha en magenta, incluido el protooncogén SRC y las proteínas de respuesta al interferón (MX1 y HLA-A; Tabla complementaria 6). f, validación IHC de resultados proteómicos. CNN1, SRC, CK5 y FASN están significativamente enriquecidos en tejido normal o canceroso. Barra de escala, 100 μm.

Para identificar las firmas de proteínas específicas de la enfermedad, nuestro objetivo fue comparar las células acinares de apariencia histológicamente normal con las células malignas en lugar de mezclarlas con proporciones variables de células no relacionadas. Con este fin, clasificamos las células acinares y de conductos del tejido de la glándula parótida normal en función de sus características morfológicas específicas del tipo de célula y clases de células individuales aisladas para el análisis proteómico (Fig. 4c y Datos extendidos Fig. 4a). El análisis bioinformático de las diferencias del proteoma medido reveló diferencias biológicas significativas entre estos tipos de células vecinas, lo que refleja sus distintas funciones fisiológicas. Las células acinares, que producen y secretan saliva en gránulos secretores, mostraron una alta expresión de proteínas relacionadas con el transporte de vesículas y la glicosilación junto con marcadores de células acinares conocidos como α-amilasa (AMY1A), CA6 y PIP (datos extendidos Fig. 4b). Por el contrario, las células ductales expresaron altos niveles de mitocondrias y proteínas relacionadas con el metabolismo necesarias para satisfacer la alta demanda de energía para la secreción de saliva25 (Datos extendidos Fig. 4c y Tabla complementaria 5). A modo de comparación, extirpamos exclusivamente células acinares malignas y benignas de las diversas regiones dentro de la misma sección de tejido. Los proteomas de las células acinares se agruparon independientemente del estado de la enfermedad, lo que indica una fuerte firma de célula de origen (Datos ampliados, Fig. 4d). El análisis de seis réplicas de apariencia normal y nueve regiones neoplásicas mostró una excelente correlación del proteoma dentro del grupo (Pearson r > 0,96). La correlación más baja de células normales y células cancerosas reflejó cambios en el proteoma específicos de la enfermedad y del tipo de célula (Pearson r = 0.8; Fig. 4d, e y Tabla complementaria 6). Los marcadores de células acinares en el carcinoma estaban significativamente regulados a la baja, de acuerdo con informes previos25. DVP nos permitió descubrir la regulación positiva de las proteínas de respuesta al interferón (por ejemplo, MX1 y HLA-A; Tabla complementaria 6) y el protooncogén SRC, ambos objetivos terapéuticos accionables26 (Fig. 4e). Validamos los hallazgos proteómicos utilizando el análisis IHC de proteínas significativamente enriquecidas en tejido de apariencia normal o canceroso. Esto resultó en la selección de CNN1, SRC, CK5 y FASN (Fig. 4f), que confirmaron nuestros resultados proteómicos, demostraron la ausencia de contaminación y respaldaron la especificidad de nuestro enfoque DVP.

Descifrar las alteraciones moleculares en el desarrollo y la progresión del melanoma es clave para identificar las vulnerabilidades terapéuticas en esta enfermedad altamente metastásica. Con las mutaciones patogénicas en el melanoma catalogadas en gran medida27,28,29, nos propusimos estudiar directamente los proteomas resueltos espacialmente de distintos fenotipos celulares de progresión del melanoma (Fig. 5a, b y Datos extendidos Fig. 5a, b). Co-teñimos material tumoral primario incluido en FFPE preservado durante 17 años con dos marcadores, SOX10 y CD146, para mapear células de melanoma. Como la sobreexpresión de CD146 está implicada en la progresión del melanoma y la inmunoterapia contra CD146 se dirige a la metástasis30, utilizamos CD146 como marcador de progresión de la enfermedad en nuestro análisis. ML predijo cinco clases con una distribución espacial claramente definida: clase 1, melanoma in situ; clase 2, predominantemente tumoral; clase 3, células del microambiente tumoral; clase 4, enriquecido en regiones altas en CD146; y clase 5, enriquecido en regiones bajas en CD146. Utilizamos imágenes de alto contenido para determinar el número requerido de células para identificar fenotipos celulares estadística y analíticamente sólidos para el tipo de célula preciso y el aislamiento del estado dentro de una región espacial. Por esta razón, normalmente recolectamos alrededor de 100 células por muestra (Métodos). Incluyendo réplicas, aislamos y perfilamos 27 muestras diferentes obtenidas de siete regiones únicas de la misma sección de tejido, incluidos melanocitos normales, melanoma in situ y melanoma primario de las fases de crecimiento radial y vertical (Fig. 5a-d). Encontramos una alta reproducibilidad cuantitativa entre las réplicas biológicas, lo que resultó en un estado de enfermedad y proteomas específicos de la región (Fig. 5e-g). El melanoma precanceroso (melanoma in situ) y primario mostró diferencias en las proteínas involucradas en la señalización de las células inmunitarias y el metabolismo celular y coincidió con una melanogénesis reducida (Tabla complementaria 7 y Datos extendidos Fig. 5d). Las etapas avanzadas (fase de crecimiento del melanoma radial y vertical) mostraron una activación metabólica bien definida junto con la progresión de la enfermedad, un sello distintivo conocido de los cánceres humanos31. La expresión de proteínas involucradas en la fosforilación oxidativa y la función de las mitocondrias aumentó gradualmente desde los melanocitos, el melanoma in situ hasta el melanoma invasivo, lo que indica una dependencia de la respiración mitocondrial en las etapas tumorales avanzadas (Fig. 5h-j, Datos extendidos Fig. 5c y Tablas complementarias 7- 9). Por el contrario, las proteínas involucradas en la presentación de antígenos y la respuesta del interferón se redujeron en comparación con el melanoma in situ (Fig. 5h-j ​​y Tablas complementarias 7-9), en línea con las estrategias de evasión inmune en el melanoma32.

a, flujo de trabajo de aislamiento de muestras de DVP para perfilar el melanoma primario. b, DVP aplicado a melanoma primario teñido inmunohistoquímicamente para el marcador de melanocitos SOX10 y el marcador de melanoma CD146. Panel izquierdo: tejido de melanoma teñido en un portaobjetos de membrana de vidrio PEN. Panel derecho: anotación guiada por patología de diferentes regiones de tejido. Barra de escala, 1 mm. c, Clasificación celular guiada por patólogos y basada en ML basada en la intensidad de tinción de CD146 y SOX10 y la localización espacial: melanocitos normales, células del estroma, melanoma in situ, melanoma bajo en CD146, melanoma alto en CD146, melanoma de crecimiento radial y melanoma de crecimiento vertical. Panel inferior derecho: frecuencia de clases predichas por ML no supervisado (agrupación de k-medias). d, Imágenes de ejemplo de las siete clases identificadas. Factor de aumento = ×4400. e, Matriz de correlación (Pearson r) de las 27 muestras de proteoma medidas. f, PCA de proteomas. g, PCA de todos los proteomas específicos de melanoma desde in situ hasta melanoma invasivo (crecimiento vertical). h, agrupación jerárquica no supervisada basada en todos los 1910 grupos de proteínas significativos de ANOVA (FDR < 0,05). Se destacan dos grupos de proteínas reguladas al alza (grupo A) o reguladas a la baja (grupo B) en el melanoma invasivo. i, Mapa de calor del tejido mapeando los resultados proteómicos en los datos de imagen. Los niveles de ruta relativos de los términos seleccionados de los dos grupos se destacan en i. Los niveles medios de proteína se calcularon por anotación y se trazaron para cada clase de células aisladas frente a sus coordenadas x e y, según lo definido por sus contornos celulares segmentados. j, diagramas de caja de los niveles de proteína con puntuación z para las vías reguladas diferencialmente visualizadas en i arriba. Los diagramas de caja definen el rango de los datos (bigotes), los percentiles 25 y 75 (caja) y las medianas (línea continua). Los valores atípicos se trazan como puntos individuales fuera de los bigotes. k, Comparación de cambios proteómicos en células de melanoma con alto contenido de CD146 (clase 4) del crecimiento vertical (región 2) con el crecimiento radial (región 1). Los vasos sanguíneos próximos a las células de melanoma del crecimiento vertical se resaltan en rojo. Barra de escala, 1 mm. l, Gráfica de análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de vías significativamente enriquecidas para células de melanoma de la fase de crecimiento vertical y radial.El análisis de enriquecimiento de la ruta se basó en el cambio de pliegue de proteínas entre las células de melanoma verticales y radiales y se realizó con el paquete ClusterProfiler R36. Se muestran los términos enriquecidos con un FDR < 0,05. MHC, complejo mayor de histocompatibilidad.

La progresión del melanoma es un proceso gradual que involucra fases de crecimiento radial y vertical. La comparación directa de estas regiones definidas espacialmente del mismo fenotipo (células de clase 4) destacó aún más las características críticas de la metástasis del cáncer, como la remodelación de la matriz extracelular (ECM) (por ejemplo, la degradación del colágeno) y la señalización de PDGF regulada al alza33 (Fig. 5k, l , Datos extendidos Fig. 5e y Tabla complementaria 10). Estos cambios impulsados ​​por el tumor favorecen el crecimiento, aumentan la migración de las células tumorales y remodelan la MEC para facilitar la metástasis a órganos distantes a través de los vasos sanguíneos adyacentes33. DVP también descubrió una regulación positiva significativa del empalme de ARNm en la fase de crecimiento vertical en comparación con la radial. El splicing alternativo prooncogénico se ha convertido recientemente en una estrategia terapéutica en oncología34, y estos tumores suelen presentar neoantígenos inmunogénicos35. El aumento en el empalme coincidió con una regulación a la baja significativa de la señalización relacionada con el sistema inmunitario (señalización de interferón y presentación de antígenos) (Fig. 5l y Tabla complementaria 10), lo que sugiere la transición de una zona tumoral inmunogénica 'caliente' a una 'fría' en la vertical fase de crecimiento dentro de la misma sección del tumor. Claramente, DVP resolvió espacialmente la heterogeneidad del tumor al localizar el empalme de ARNm relacionado con el tumor, las respuestas inmunes y las vías de remodelación de ECM en diferentes regiones.

DVP combina tecnologías de imagen con proteómica imparcial para cuantificar el número de proteínas expresadas en una célula determinada, mapear proteomas específicos de tejidos o tipos de células o identificar objetivos para futuros fármacos y diagnósticos. Mostramos cómo nuestros análisis describen un rico 'microcosmos en una diapositiva', descubriendo vías clave desreguladas en la progresión del cáncer y extendiendo efectivamente la 'patología digital' por una dimensión molecular. Es ampliamente aplicable a cualquier sistema biológico del que se pueda obtener una imagen microscópica, desde el cultivo celular hasta la patología. Como un solo portaobjetos puede abarcar cientos de miles de células, DVP puede descubrir y caracterizar estados e interacciones celulares raros. A diferencia de la transcriptómica unicelular, DVP puede analizar fácilmente las estructuras subcelulares y la dinámica espacial de la MEC. Con más mejoras en la tecnología proteómica, DVP también debería ser adecuado para estudiar proteoformas y modificaciones postraduccionales a nivel de tipo de célula única.

Recolectamos muestras de tejido FFPE de archivo de carcinoma de células acínicas de glándulas salivales y melanoma del Departamento de Patología del Hospital Universitario de Zelanda, en Roskilde, Dinamarca. El tejido de melanoma era de un hombre de 51 años y estaba ubicado en la parte superior izquierda del tórax. El estadio TNM al diagnóstico era T3aN1M0. El subtipo histológico fue melanoma de extensión superficial; el nivel de Clark fue 4; y el espesor Breslow fue de 2,27 mm. La infiltración inmune tumoral se clasificó como no rápida. La muestra FFPE tenía 17 años. El paciente experimentó recurrencia en diferentes localizaciones 17 meses después del diagnóstico y falleció a los 71 meses. El carcinoma de células acinares se extrajo de la glándula parótida derecha de un hombre de 29 años. No había signos de mitosis, necrosis desdiferenciada o crecimiento perineural o intravascular. Las células tumorales fueron positivas en EpCAM, CK7, DOG1 y SOX10. La mamaglobina fue negativa. La muestra tenía 4 años y actualmente el paciente se encuentra libre de enfermedad. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las pautas institucionales con la aprobación del Comité de Revisión de Ética Médica local (SJ-742) y la Agencia de Protección de Datos (REG-066-2019) y de acuerdo con la ley danesa (Ley de Investigación Médica que Involucra a Seres Humanos) . El tejido de la trompa de Falopio que se muestra en la Fig. 2 es de una mujer de 64 años y tenía un aspecto macroscópico e histológico normal. Todos los pacientes dieron su consentimiento antes de la cirugía. Los tejidos derivados de pacientes se obtuvieron frescos o incluidos en parafina de acuerdo con un protocolo de la junta de revisión institucional aprobado (13372B) en el hospital de la Universidad de Chicago. De acuerdo con la aprobación del Comité de revisión de ética médica, todas las muestras de tejido de pacientes humanos de la FFPE quedaron exentas del consentimiento, ya que estos estudios utilizaron muestras patológicas archivadas existentes. Las muestras de tejido humano fueron evaluadas por un patólogo certificado por la junta.

La línea celular de osteosarcoma humano U2OS se cultivó en DMEM (glucosa alta, GlutaMAX) que contenía FBS al 10 % y penicilina-estreptomicina (Thermo Fisher Scientific).

Las celdas U2OS FUCCI fueron proporcionadas amablemente por Atsushi Miyawaki14. Estas células están marcadas endógenamente con dos proteínas fluorescentes fusionadas con los reguladores del ciclo celular CDT1 (mKO2-hCdt1+) y geminina (mAG-hGem+). CDT1 se acumula durante la fase G1, mientras que geminina se acumula en las fases S y G2, lo que permite el seguimiento del ciclo celular. Las células se cultivaron a 37 °C en un entorno humidificado con CO2 al 5,0 % en medio GlutaMAX 5A (modificado) de McCoy (Thermo Fisher Scientific, 36600021) suplementado con FBS al 10 % (VWR) sin antibióticos.

Se generaron células U2OS que expresaban de manera estable una forma de eGFP dirigida a la membrana mediante transfección con plásmido Lck-GFP (Addgene, 61099 (ref. 37)) y cultivo en medio de selección (medio DMEM que contenía 10 % de FBS, penicilina-estreptomicina y 400 μg ml −1 de Geneticina) en condiciones de dilución limitada para producir colonias individuales. Se estableció una línea celular clonal con niveles de expresión homogéneos y moderados de Lck-eGFP en la membrana plasmática a partir de una única colonia.

Todas las líneas celulares se analizaron para detectar micoplasma (MycoAlert, Lonza) y se autenticaron mediante perfiles STR (IdentiCell).

Los portaobjetos de membrana PEN 1.0 (Zeiss, 415190-9041-000) se trataron con luz UV durante 1 hora y se recubrieron con APES (3-aminopropiltrietoxisilano) utilizando el reactivo VECTABOND (Vector Labs, SP-1800-7) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se cortaron secciones de tejido FFPE (2,5 µm), se secaron al aire a 37 °C durante la noche y se calentaron a 60 °C durante 20 minutos para facilitar una mejor adhesión del tejido. A continuación, las secciones se desparafinaron, se rehidrataron y se cargaron en húmedo en el instrumento completamente automatizado Omnis (Dako). La recuperación de antígenos se llevó a cabo utilizando Target Retrieval Solution pH 9 (Dako, S2367) diluida 1:10 y calentada durante 60 minutos a 90 °C. Tinción única para EpCAM (Nordic BioSite, clon BS14, BSH-7402-1, dilución 1:400) y doble tinción secuencial para SOX10/CD146 (SOX10, Nordic BioSite, clon BS7, BSH-7959-1, dilución 1:200; CD146, Cell Marque, clon EP54, AC-0052, dilución 1:400) y los portaobjetos se incubaron durante 30 minutos (32 °C). Después de lavar y bloquear la actividad de la peroxidasa endógena, las reacciones se detectaron y visualizaron utilizando el kit de pH alto EnVision FLEX (Dako, GV800 y GV809/GV821) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En la tinción doble, se utilizaron los sistemas cromógenos de sustrato EnVision DAB (Dako, GV825) y EnVision Magenta (Dako, GV900) para la visualización de CD146 y SOX10, respectivamente. Finalmente, los portaobjetos se enjuagaron con agua, se contrastaron con hematoxilina de Mayer y se secaron al aire sin montar.

Se cortaron secciones de tejido FFPE (2,5 µm), se colocaron en portaobjetos recubiertos (Agilent/Dako, K8020) y se secaron al aire verticalmente antes de calentar a 60 °C durante 20 minutos para facilitar la adhesión del tejido. A continuación, se cargaron los portaobjetos en el instrumento totalmente automatizado Omnis. Las secciones se desparafinaron y la recuperación del antígeno se llevó a cabo utilizando Target Retrieval Solution High pH (Agilent/Dako, GV804, diluido 1:50) a 97 °C durante 24 minutos. Posteriormente, las secciones se incubaron con los anticuerpos primarios. Seleccionamos anticuerpos evaluados y aprobados por un patólogo consultor certificado por la junta. Protooncogén tirosina proteína quinasa SRC/c-Src (Cell Signaling Technology, clon 36D10, 2109, dilución 1:3,200), ácido graso sintasa/FASN (Cell Signaling Technology, clon C20G5, 3180, dilución 1:100), calponina- 1/CNN1 (Cell Marque, clon EP63, AC-0060, dilución 1:300) y citoqueratina 5/CK5 (Leica Biosystems, clon XM26, NCL-L-CK5, dilución 1:200) durante 30 minutos a 32 °C. Después de lavar y bloquear la actividad de la peroxidasa endógena, las reacciones se detectaron y visualizaron usando el kit de pH alto EnVision FLEX (Agilent/Dako, GV800 y GV809/GV821) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Finalmente, los portaobjetos se enjuagaron con agua, se contrastaron con hematoxilina de Mayer y se cubrieron con cubreobjetos.

Las células se incubaron primero con 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) durante 20 minutos y luego se fijaron durante 5 minutos a temperatura ambiente con paraformaldehído (PFA) al 4 % y se lavaron tres veces con PBS. A continuación, las células se permeabilizaron con PBS/Triton X-100 al 0,2 % durante 2 minutos en hielo y se lavaron tres veces con PBS. A continuación, las células se tiñeron con un kit de marcaje EdU (Life Technologies) y se contratiñeron con Hoechst 33342 durante 10 minutos. Los portaobjetos se montaron con montura GB (GBI Labs, E01-18).

Para los experimentos de validación (Datos ampliados, Fig. 3), se recubrieron placas con fondo de vidrio de 96 pocillos (Greiner SensoPlate Plus, Greiner Bio-One) con 12,5 µg ml−1 de fibronectina humana (Sigma-Aldrich) durante 1 hora a temperatura ambiente. . La inmunocitoquímica se realizó siguiendo un protocolo establecido38. Luego, se sembraron 8000 células U2OS en cada pozo y se incubaron en un ambiente de 37 °C y 5 % de CO2 durante 24 horas. Las células se lavaron con PBS, se fijaron con 40 µl de PFA helado al 4 % y se permeabilizaron con 40 µl de 0,1 Triton X-100 en PBS durante 3 x 5 minutos. Los anticuerpos HPA policlonales de conejo dirigidos a las proteínas de interés se diluyeron en tampón de bloqueo (PBS + FBS al 4 %) a 2–4 ​​µg ml−1 junto con los anticuerpos marcadores primarios (ver más abajo) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Las células se lavaron con PBS durante 4 x 10 minutos y se incubaron con anticuerpos secundarios (anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488 (A11034, Thermo Fisher Scientific), anti-ratón de cabra Alexa Fluor 555 (A21424, Thermo Fisher Scientific) y anti-pollo de cabra. Alexa Fluor 647 (A21449, Thermo Fisher Scientific)) en tampón de bloqueo a 1,25 µg ml−1 durante 90 minutos a temperatura ambiente. Las células se contratiñeron en 0,05 µg ml-1 de DAPI durante 15 minutos, se lavaron durante 4 x 10 minutos y se montaron en PBS.

Los anticuerpos primarios utilizados fueron los siguientes:

Para la validación del ciclo celular C7orf50: anti-ANLN de ratón a 1,25 µg ml−1 (amab90662, Atlas Antibodies)

Ratón anti CCNB1 a 1 µg ml−1 (610220, BD Biosciences)

Conejo anti-C7orf50 a 1 µg ml−1 (HPA052281, Atlas Antibodies)

Para tejido de trompa de Falopio humano, se montaron y preprocesaron secciones de tejido FFPE (2,5 µm) como se describe anteriormente. Posteriormente, el tejido se desparafina lavando 2 x 2 minutos en xileno al 100 %, seguido de una serie de etanol al 100 %, 95 % y 70 % durante 1 minuto, respectivamente, y 3 x 1 minuto en ddH2O. La recuperación del antígeno se realizó en un baño de agua empleando tampón de recuperación EDTA (EDTA 1 mM, Tween 20 al 0,05 %, pH 8,0) a 95 °C durante 1 hora. Después de una fase de enfriamiento de 1 hora a temperatura ambiente, se realizó el bloqueo con suero de cabra al 10 % en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios dirigidos a FOXJ1 (ratón, dilución 1:200, 14-9965-80, Invitrogen) y EpCAM (conejo, dilución 1:200, 14452, Cell Signaling Technology) se diluyeron en suero de cabra al 10 % y se incubaron durante la noche a 4 °C. en una cámara humidificada. Las muestras de tejido se lavaron 5 veces en TBST y anticuerpos secundarios para la visualización de FOXJ1 (Alexa Fluor 647 cabra anti-ratón, dilución 1:200, A21235, Invitrogen) y EpCAM (Alexa Fluor 555 cabra anti-conejo, dilución 1:200, A21428, Invitrogen) y SYTO 10 para visualización nuclear (10624243, Invitrogen) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Las muestras se lavaron 5 veces en TBST, seguidas de 2 veces en TBS y se cubrieron con cubreobjetos para imágenes de alto contenido.

Las imágenes de cultivos celulares marcados con inmunofluorescencia se adquirieron utilizando un microscopio AxioImager Z.2 (Zeiss), equipado con óptica de campo amplio, un objetivo seco ×20, 0,8 NA y un conjunto de filtros de banda cuádruple para Hoechst, FITC, Cy3 y Cy5 colorantes fluorescentes. La adquisición de campo amplio se realizó utilizando la fuente de luz LED Colibri 7 y una cámara mono AxioCam 702 con 5,86 μm por píxel. Se adquirieron pilas Z con 19 cortes Z en incrementos de 3 mm para capturar el plano de enfoque óptimo. Las imágenes se obtuvieron automáticamente con Zeiss ZEN 2.6 (edición azul) en condiciones de no saturación (rango dinámico de 12 bits).

Se obtuvieron imágenes IHC de glándulas salivales y tejido de melanoma utilizando el escáner de portaobjetos automatizado Zeiss Axio Scan.Z1 para microscopía de campo claro. La adquisición de campo brillante se obtuvo utilizando la fuente de luz LED VIS y una cámara CCD Hitachi HV-F202CLS. Los portaobjetos PEN se escanearon con un objetivo seco ×20, 0,8 NA con una resolución de 0,22 mm por píxel. Se adquirieron pilas Z con ocho cortes Z en incrementos de 2 mm para capturar el plano de enfoque óptimo. Las imágenes en color se obtuvieron automáticamente con Zeiss ZEN 2.6 (edición azul) en condiciones de no saturación (rango dinámico de 12 bits).

Se tomaron imágenes de las células en un microscopio de campo amplio Leica Dmi8 equipado con un objetivo de aire 0.8 NA, ×40 y una cámara Hamamatsu Flash 4.0 V3 usando el software LAS X. La segmentación de cada célula se realizó utilizando el software Cell Profiler8 utilizando DAPI para la segmentación de núcleos. La intensidad media de la proteína diana y la proteína marcadora del ciclo celular se midió en el núcleo. Las células se agruparon en las fases G1 y G2 del ciclo celular utilizando el cuantil 0,2 y 0,8 de los niveles de intensidad de ANLN o CCNB1 en el núcleo, y la expresión dependiente del ciclo celular de C7orf50 se validó comparando las diferencias en los niveles de expresión entre G1 y células G2.

Para extirpar células o núcleos, utilizamos el sistema Leica LMD7, que adaptamos para la automatización automatizada de una sola célula. Se logró una alta precisión de corte utilizando un objetivo CORR XT HC PL FLUOTAR L ×63/0,70 (tejido) o ×40/0,60 (cultivos celulares). Utilizamos el software Leica Laser Microdissection V 8.2.3.7603 (adaptado para este proyecto) para la escisión completamente automatizada y la recolección de contornos. Para el análisis del proteoma tisular FFPE, recolectamos de 50 a 100 células por muestra (área total recolectada × grosor del portaobjetos / volumen promedio de células de mamífero de 2000 µm3; BNID 100434), de acuerdo con las estimaciones en el análisis de transcriptómica espacial39.

Precisión de corte de Leica LMD7 (Leica R&D, patente EP1276586)

Para el objetivo ×150: \({\frac{10}{150}} = 0,07\,\upmu{\mathrm{m}}\)

Los modelos nucleAIzer3 se integraron en BIAS y se personalizaron para estos experimentos volviendo a entrenar y refinando los modelos de segmentación del núcleo y el citoplasma. En primer lugar, el aprendizaje de transferencia de estilo5 se realizó de la siguiente manera. Dado un nuevo escenario experimental, como nuestro melanoma o secciones de tejido de glándulas salivales teñidas inmunohistoquímicamente, cuya adquisición produce un tipo de imagen para el que no existen datos de entrenamiento anotados, lo que impide una segmentación eficiente incluso con métodos de DL potentes. Con una segmentación inicial o contorneado manual por parte de expertos (denominado anotación), se adquiere un pequeño conjunto de datos de máscara (las máscaras representan, por ejemplo, núcleos), que se utiliza para generar nuevas imágenes de máscara (sintéticas) de modo que la distribución espacial, la densidad y las propiedades morfológicas de los objetos generados (por ejemplo, núcleos) son similares a las medidas en las imágenes anotadas. Las máscaras iniciales y sus correspondientes imágenes de microscopía se usan para entrenar un modelo de transferencia de estilo de imagen que aprende a generar la textura de las imágenes de microscopía en las máscaras, marcando objetos usando GANs40 (redes generativas antagónicas): primer plano para imitar, por ejemplo, núcleos y fondo para rodear, por ejemplo, estructuras tisulares. Paralelamente, se crearon máscaras artificiales de objetos de núcleo o citoplasma y se introdujeron en la red de aprendizaje de transferencia de estilo de imagen que generó imágenes de microscopía sintética de aspecto realista con la apariencia visual del experimento original. Por lo tanto, con estos datos de entrenamiento creados artificialmente (imágenes de microscopía sintética y sus correspondientes máscaras, también sintéticas), su modelo de segmentación aplicado, Máscara R-CNN, está preparado para el nuevo tipo de imagen y puede segmentar con precisión los compartimentos objetivo.

Comparamos la precisión del enfoque de segmentación en una línea celular fluorescente Lck-U2OS, así como en muestras de tejido de melanoma, glándula salival y trompa de Falopio, y comparamos los resultados con tres métodos adicionales, incluidos dos enfoques DL: unet4nuclei (indicado como M1 en la Fig. 2a y S1)6 y Cellpose (M3)7, junto con una aplicación basada en división de objetos y umbral adaptativo convencional ampliamente utilizada (M2)8. Observamos que M1 no está destinado a la segmentación del citoplasma (ver detalles en la referencia 6 y más abajo). La precisión de la segmentación según la métrica F1 se muestra como gráficos de barras (Fig. 2b, Datos extendidos Fig. 1a, Tabla 1 y Tabla complementaria 1), y también se proporciona una representación visual codificada por colores.

unet4nuclei6 está optimizado para segmentar núcleos en imágenes de cultivos celulares; Cellpose7 es un enfoque destinado a la segmentación del núcleo o del citoplasma en varios tipos de imágenes de microscopía; y CellProfiler8 es un software convencional basado en umbrales y división de objetos ampliamente utilizado en la comunidad de análisis de bioimágenes. unet4nuclei, como su nombre indica, está destinado principalmente a la segmentación de núcleos y utiliza una red basada en U-Net después del preprocesamiento de las imágenes de entrada y luego del posprocesamiento de los objetos detectados. Cellpose utiliza una representación de flujo vectorial de instancias, y su red neuronal (también basada en U-Net) predice y combina flujos horizontales y verticales. unet4nuclei se ha aplicado con éxito en la segmentación de núcleos de cultivos celulares, mientras que Cellpose es capaz de generalizar bien en varias modalidades de imagen incluso fuera de la microscopía y se puede utilizar para segmentar núcleos y citoplasmas. Sin embargo, como la mayoría de los métodos de segmentación, ninguno es capaz de adaptarse a un nuevo dominio de imagen, como un tipo de experimento particular (por ejemplo, tejido de glándulas salivales IHC), sin volver a entrenarse en anotaciones de verdad del terreno recién creadas. Por el contrario, nuestro algoritmo de segmentación (nucleAIzer3) puede hacerlo a través del enfoque de transferencia de estilo de imagen mencionado anteriormente. Obviamente, los algoritmos convencionales tampoco pueden adaptarse; por lo tanto, deben volver a parametrizarse para cada experimento. Para la evaluación, se pidió a un usuario experto de CellProfiler que optimizara una canalización para cada tipo de muestra con el mejor resultado de segmentación posible, y luego todas las imágenes por tipo de muestra se segmentaron con una canalización (correspondiente a la muestra dada).

Evaluamos nuestro rendimiento de segmentación (y comparaciones) de acuerdo con la métrica de puntaje F1 calculada en el umbral de 0.7-IoU (intersección sobre unión). IoU, también conocido como índice de Jaccard, se calculó a partir de la región superpuesta del objeto predicho (segmentado) con su correspondiente objeto real (real) en un umbral dado (consulte la formulación a continuación). Los objetos verdaderos positivos (TP), falsos positivos (FP) y falsos negativos (FN) se contaron en consecuencia, si tenían un IoU mayor que el umbral t (en nuestro caso, 0,7), para obtener la puntuación F1 en este momento. umbral (ver formulación a continuación). La evaluación de la segmentación se realizó en 10 a 20 imágenes seleccionadas al azar de regiones visualmente distintas para cada tipo de muestra (células U2OS y melanoma, glándulas salivales y tejidos de las trompas de Falopio) para mostrar la solidez, en comparación con las anotaciones reales dibujadas por expertos utilizando AnnotatorJ41. Incluimos imágenes de todas las regiones relevantes de cada muestra, por ejemplo, células de los conductos, células acinos, células sin tinción de membrana y linfocitos, en el tejido de la glándula salival y de manera similar para las otras muestras, para garantizar la robustez. Los contornos o contornos de todos los objetos visibles (núcleo o citoplasma) se dibujaron individualmente y luego se exportaron para enmascarar imágenes en el mismo formato que arrojó la segmentación (máscaras de segmentación de instancias con intensidades de gris crecientes por objetos). Las máscaras de verdad de tierra se usaron únicamente en la evaluación; el aprendizaje de transferencia de estilo de imagen antes mencionado se entrenó en máscaras obtenidas automáticamente de los nuevos experimentos. Teniendo en cuenta las puntuaciones medias de F1 medidas, concluimos que el método aplicado de segmentación basado en DL3 disponible en BIAS produjo segmentaciones tanto a nivel del núcleo como del citoplasma con una calidad superior a la de los métodos comparados (véanse los resultados en la Fig. 2a,b y la Fig. 1a).

Los resultados de nuestra evaluación de la segmentación del núcleo y del cuerpo celular en tejidos de melanoma, glándulas salivales y epitelio de las trompas de Falopio y células U2OS se presentan en la Tabla 1.

Estos resultados se correlacionan con nuestro estudio anterior3 que mostró un rendimiento superior de nucleAIzer en varias modalidades de datos de imágenes de microscopía (cultivo de células fluorescentes, tejido con hematoxilina y eosina y otros escenarios experimentales) en comparación con enfoques de segmentación múltiple, incluidos, por ejemplo, M2 e ilastik9.

También notamos que los métodos anteriores, como CellProfiler o ilastik, pueden realizar una segmentación precisa de las celdas; además, el rendimiento de M2 ​​en la segmentación del núcleo del tejido es notable. Por otro lado, los métodos robustos (por ejemplo, basados ​​en DL) ofrecen la comodidad de no necesitar restablecer la mayoría de los parámetros cuando se trabaja con imágenes de una muestra o tipo diferente.

El cultivo celular (núcleos o células completas) y las muestras de tejido se recogieron mediante LMD automatizado en placas de 384 pocillos (Eppendorf, 0030129547). Para la recolección de diferentes clases de núcleos U2OS (Fig. 3 y datos extendidos, Figs. 2 y 3), normalizamos las diferencias de tamaño nuclear (que dieron como resultado diferentes cantidades de proteína total) por el número de objetos recolectados por clase. En promedio, recolectamos 267 núcleos por muestra. Para muestras de tejido FFPE de glándula salival y melanoma (secciones de 2,5 µm de espesor cortadas con un micrótomo), se recolectó un área de 80 000–160 000 µm2 por muestra para un número estimado de 100–200 células según el volumen promedio de células HeLa de 2000 μm3 (BNID 100434).

A continuación, se añadieron 20 µl de bicarbonato de amonio (ABC) a cada pocillo de muestra y se cerró la placa con cinta de sellado (Corning, CLS6569-100EA). Después de agitar en vórtex durante 10 segundos, las placas se centrifugaron durante 10 minutos a 2000 g y se calentaron a 95 °C durante 30 minutos (cultivo celular) o 60 minutos (tejido) en un termociclador (Bio-Rad S1000 con módulo de reacción de 384 pocillos) a una temperatura de tapa constante de 110 °C. A continuación, se añadieron 5 µl de tampón de digestión 5X (acetonitrilo al 60 % en ABC 100 mM) y las muestras se calentaron a 75 °C durante otros 30 minutos. Las muestras se enfriaron brevemente y se añadió 1 µl de LysC (prediluido en agua ultrapura hasta 4 ng µl−1) y se digirieron durante 4 horas a 37 °C en el termociclador. Posteriormente, se añadieron 1,5 µl de tripsina (prediluida en agua ultrapura hasta 4 ng µl−1) y se incubó durante la noche a 37 °C en el termociclador. Al día siguiente, se detuvo la digestión añadiendo ácido trifluoroacético (TFA, concentración final 1 % v/v) y las muestras se secaron al vacío (aproximadamente 1,5 horas a 60 °C). A continuación, se añadieron 4 µl de tampón de carga de MS (acetonitrilo al 3 % en TFA al 0,2 %) y la placa se agitó durante 10 segundos y se centrifugó durante 5 minutos a 2000 g. Las muestras se almacenaron a -20 °C hasta el análisis por cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS).

Utilizamos el fraccionamiento de fase inversa de pH alto para generar una biblioteca profunda de precursores de células U2OS para el análisis de MS independiente de los datos (abajo). Los péptidos se fraccionaron a pH 10 con el spider-fractionator42. A continuación, se separaron 30 μg de péptidos purificados en una columna C18 de 30 cm en 100 minutos y se concatenaron en 12 fracciones con interruptores de válvula de salida de 90 segundos. Las fracciones de péptidos se secaron al vacío y se reconstituyeron en tampón de carga de MS para el análisis de LC-MS.

El análisis LC-MS se realizó con un sistema EASY-nLC-1200 (Thermo Fisher Scientific) conectado a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo de espectrometría de movilidad de iones atrapados modificado con una corriente de iones cinco veces mayor (timsTOF Pro, Bruker Daltonik ) con una fuente de iones de nanoelectrospray (CaptiveSpray, Bruker Daltonik). El muestreador automático se configuró para recoger muestras de placas de 384 pocillos.

Los péptidos se cargaron en una columna de HPLC empaquetada internamente de 50 cm (diámetro interno de 75 µm empaquetada con perlas de sílice ReproSil-Pur C18-AQ de 1,9 µm, Dr. Maisch).

Los péptidos se separaron usando un gradiente lineal del 5 al 30 % de tampón B (0,1 % de ácido fórmico y 80 % de ACN en agua de grado LC-MS) en 55 minutos, seguido de un aumento al 60 % durante 5 minutos y un 10 minutos. lavar en tampón B al 95 % a 300 nl min−1. El tampón A constaba de ácido fórmico al 0,1 % en agua de grado LC-MS. La duración total del gradiente fue de 70 minutos. Utilizamos un horno de columna de fabricación propia para mantener constante la temperatura de la columna a 60 °C.

El análisis espectrométrico de masas se realizó como se describe en Brunner et al., ya sea en modo dependiente de datos (ddaPASEF) (Fig. 4) o independiente de datos (diaPASEF) (Figs. 2, 3 y 5). Para ddaPASEF, se adquirieron un TIMS-MS de encuesta MS1 y diez escaneos PASEF MS/MS por ciclo de adquisición. La acumulación de iones y el tiempo de rampa en el analizador TIMS dual se establecieron en 100 ms cada uno, y analizamos el rango de movilidad de iones de 1/K0 = 1,6 Vs cm−2 a 0,6 Vs cm−2. Los iones precursores para el análisis de MS/MS se aislaron con una ventana de 2-Th para m/z < 700 y 3-Th para m/z > 700 en un rango total de m/z de 100 a 1,700 mediante la sincronización de eventos de conmutación de cuadrupolo con el precursor perfil de elución del dispositivo TIMS. La energía de colisión se redujo linealmente en función del aumento de la movilidad a partir de 59 eV a 1/K0 = 1,6 Vs cm−2 a 20 eV a 1/K0 = 0,6 Vs cm−2. Los iones precursores cargados individualmente se excluyeron con un filtro poligonal (otof control, Bruker Daltonik). Los precursores para MS/MS se seleccionaron en un umbral de intensidad de 1000 unidades arbitrarias (au) y se volvieron a secuenciar hasta alcanzar un "valor objetivo" de 20 000 au, teniendo en cuenta una exclusión dinámica de 40 segundos de elución. Para el análisis independiente de los datos, utilizamos la correlación de la movilidad de iones con m/z y sincronizamos la elución de los precursores de cada escaneo de movilidad de iones con la ventana de aislamiento de cuadrupolo. La energía de colisión aumentó linealmente en función de la movilidad iónica desde 59 eV a 1/K0 = 1,6 Vs cm−2 hasta 20 eV a 1/K0 = 0,6 Vs cm−2. Utilizamos el método ddaPASEF para la generación de bibliotecas.

Los archivos brutos de espectrometría de masas adquiridos en modo ddaPASEF (Fig. 4) se analizaron con MaxQuant (versión 1.6.7.0)43,44. Se realizaron búsquedas en la base de datos UniProt (versión de 2019, UP000005640_9606) con una coincidencia espectral de péptidos y FDR de nivel de proteína del 1 %. Se requirió un mínimo de siete aminoácidos, incluida la acetilación N-terminal y la oxidación de metionina como modificaciones variables. Debido a la reducción y alquilación omitidas, la carbamidometilación de cisteína se eliminó de las modificaciones fijas. La especificidad de la enzima se fijó en tripsina con un máximo de dos escisiones perdidas permitidas. La tolerancia de masa de búsqueda principal y primera se fijó en 70 ppm y 20 ppm, respectivamente. Las identificaciones de péptidos por MS/MS se transfirieron haciendo coincidir los patrones de isótopos de cuatro dimensiones entre las ejecuciones (MBR) con una ventana de coincidencia de tiempo de retención de 0,7 minutos y una ventana de movilidad de iones de 0,05 1/K0. La cuantificación sin etiquetas se realizó con el algoritmo MaxLFQ45 y un recuento de relación mínimo de 1.

Para las mediciones de diaPASEF (Figs. 2, 3 y 5), los archivos sin procesar se analizaron con DIA-NN46 (versión 1.8). Para generar una biblioteca espectral específica del proyecto, se creó una biblioteca de precursores fraccionados en fase inversa de pH alto de 24 fracciones a partir de la misma muestra de tejido y se adquirió en modo ddaPASEF, como se describe anteriormente. Los archivos sin procesar se analizaron con MSFragger47 con la configuración predeterminada (con la excepción de que la carbamidometilación de cisteína se eliminó de las modificaciones fijas) para generar el archivo de biblioteca utilizado en DIA-NN. La biblioteca constaba de 90.056 precursores, 79.802 grupos de elución y 7.765 grupos de proteínas.

El análisis de datos de proteómica se realizó con Perseus48 y dentro del entorno R (https://www.r-project.org/). Las tablas de salida de MaxQuant se filtraron para 'Reversa', 'Solo identificado por modificación del sitio' y 'Contaminantes potenciales' antes del análisis de datos. Los datos se filtraron estrictamente para mantener las proteínas con solo un 30 % o menos de valores faltantes (aquellos que se muestran como 0 en la salida de MaxQuant). Los valores faltantes se imputaron en base a una distribución normal (ancho = 0,3; cambio descendente = 1,8) antes de la prueba estadística. PCA se realizó en R. Para las comparaciones proteómicas de muestras múltiples (ANOVA) o por pares (prueba t no pareada de dos caras), aplicamos un FDR basado en permutación del 5% para corregir las pruebas de hipótesis múltiples. Se utilizó un valor s049 de 0,1 para la comparación proteómica por pares en las Figs. 2h y 4e. El análisis de enriquecimiento de vías se realizó en Perseus (Tablas complementarias 2, 3, 5 y 9; prueba exacta de Fisher con Benjamini-Hochberg FDR de 0,05) o ClusterProfiler36 (Tablas complementarias 7 y 10), el paquete ReactomePA50 y el kit de herramientas de análisis de conjuntos de genes WebGestalt ( WebGestaltR)51, con un filtro FDR de 0,05, respectivamente. El tamaño mínimo de la categoría se fijó en 20 y el tamaño máximo en 500.

Para visualizar los resultados combinados de microscopía y proteómica basada en MS, exportamos los archivos de datos espaciales para cada clase predicha del software BIAS. Esta exportación genera archivos de salida .xml con la geometría y la ubicación de las celdas dentro de una clase. Utilizamos Python para extraer esta información y agregarla en un marco de datos. Luego trazamos el centroide (coordenadas x-y) de cada celda en un diagrama de dispersión y superpusimos los datos proteómicos. Para visualizar los resultados funcionales de la proteína en un contexto espacial, realizamos un análisis de enriquecimiento de la ruta REACTOME en los resultados proteómicos generados y usamos puntajes de enriquecimiento normalizados (puntajes z) como un gradiente de color que refleja la sobrerrepresentación de una ruta determinada.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE52 con el identificador de conjunto de datos PXD023904. Se puede acceder a los datos sin procesar de BIAS, datos sin procesar de imágenes, un conjunto de datos de demostración y material en línea sobre cómo instalar BIAS y reproducir nuestro trabajo en la base de datos BioStudies del Instituto Europeo de Bioinformática53 (https://www.ebi.ac.uk/biostudies/) con el número de acceso S-BSST820. Utilizamos la base de datos UniProt (versión de 2019, UP000005640_9606, https://www.uniprot.org) para todas las búsquedas de archivos sin procesar de espectrometría de masas.

Una versión compilada gratuita de BIAS con capacidades limitadas de alto rendimiento está disponible en BioStudies Archive (número de acceso S-BSST820), que contiene todas las funciones aplicadas en los flujos de trabajo descritos. Varios componentes importantes de nuestro trabajo están disponibles en repositorios de código abierto (Tabla complementaria 11).

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Los autores agradecen a M. Rykær, J. Madsen (plataforma de espectrometría de masas de RCP de NNF, Universidad de Copenhague) y L. Drici (programa de proteómica de RCP de NNF), así como a J. Mueller (MPIB de Múnich) por su asistencia técnica. Agradecemos a F. Hoffmann, C. Greb y F. Schlaudraff de Leica por su apoyo técnico; T. Danka y M. Kovács por sus fructíferos debates científicos; y T. Hartig Braunstein, P. Hernandez-Varas y C. Prats del Core Facility of Integrated Microscopy por el soporte de microscopía. Agradecemos a J. Lukas por el apoyo y la orientación científica y a J. Percival por las ilustraciones científicas (Illustration Ltd.). Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Novo Nordisk (acuerdos de subvención NNF14CC0001 y NNF15CC0001) y la Sociedad Max Planck para el Avance de la Ciencia y por la Iniciativa Chan Zuckerberg para la financiación parcial del trabajo del ciclo celular (subvención CZF2019-002448) a E Lundberg, MM y PH. FC reconoce el Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención 846795 (subvención Marie Skłodowska-Curie) y el Ministerio de Educación e Investigación de Alemania (BMBF), como parte del Nodo Nacional de Investigación 'Espectrometría de Masas en Medicina de Sistemas' (MSCoreSys ), bajo el acuerdo de subvención 161L0222. BDA reconoce el apoyo de la Fundación Lundbeck (R252-2017-1414) y la Fundación Novo Nordisk (NNF20OC0065720). PH, RH, FK, EM y AK reconocen el apoyo de LENDULET-BIOMAG Grant (2018-342), Fondos Europeos de Desarrollo Regional (GINOP-2.2.1-15-2017-00072), H2020 (ERAPERMED-COMPASS, ERAPERMED-SYMMETRY , DiscovAIR, FAIR-CHARM), OTKA-SNN, TKP2021-EGA09 y becas ELKH-Excellence. E. Lengyel cuenta con el apoyo de NIH R35CA264619 y la Iniciativa Chan Zuckerberg (CZIF2019-002435). Reconocemos a S. Ito y H. Masai (Instituto Metropolitano de Ciencias Médicas de Tokio) por proporcionar la línea celular estable U2OS FUCCI. El plásmido LCK-GFP fue un regalo de S. Green (Addgene, plásmido 61099).

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Sociedad Max Planck.

Estos autores contribuyeron igualmente: Andreas Mund, Fabian Coscia.

Programa de Proteómica, Centro de Investigación de Proteínas de la Fundación Novo Nordisk, Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

Andreas Mund, Fabian Coscia, Alberto Santos, Beatrice Dyring-Andersen y Matthias Mann

Grupo de Proteómica Espacial, Centro Max Delbrück de Medicina Molecular en la Asociación Helmholtz, Berlín, Alemania

Fabián Coscia

Unidad de Biología Sintética y de Sistemas, Centro de Investigación Biológica, Red de Investigación Eötvös Loránd, Szeged, Hungría

András Kriston, Réka Hollandi, Ferenc Kovács, Ede Migh y Peter Horvath

Single-Cell Technologies Ltd., Szeged, Hungría

András Kriston, Ferenc Kovács y Peter Horvath

Proteómica y transducción de señales, Instituto Max Planck de Bioquímica, Martinsried, Alemania

Andreas-David Brunner, Lisa Schweizer y Matthias Mann

Center for Health Data Science, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

Alberto Santos

Big Data Institute, Li-Ka Shing Center for Health Information and Discovery, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Alberto Santos

Departamento de Patología, Hospital Universitario de Zelanda, Roskilde, Dinamarca

Michael Bzorek, Soraya Naimy y Lise Mette Rahbek-Gjerdrum

Instituto de Medicina Clínica, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

Lise Mette Rahbek-Gjerdrum

Departamento de Dermatología y Alergia, Hospital Herlev and Gentofte, Universidad de Copenhague, Hellerup, Dinamarca

Beatrice Dyring-Andersen

Centro de Investigación de Inmunología de la Piel de la Fundación Leo, Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

Beatrice Dyring-Andersen

Plataforma de Imagen de Proteínas, Centro de Investigación de Proteínas de la Fundación Novo Nordisk, Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

Jutta Bulkescher y Claudia Lukas

Programa de Señalización de Proteínas, Centro de Investigación de Proteínas de la Fundación Novo Nordisk, Facultad de Salud y Ciencias Médicas, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

claudia lucas

Departamento de Obstetricia y Ginecología/Sección de Oncología Ginecológica, Universidad de Chicago, Chicago, IL, EE. UU.

Mark Adam Eckert y Ernst Polonia

Laboratorio Science for Life, Facultad de Ciencias de la Ingeniería en Química, Biotecnología y Salud, KTH - Royal Institute of Technology, Estocolmo, Suecia

Christian Gnann y Emma Lundberg

Departamento de Bioingeniería, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

emma lundberg

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, EE. UU.

emma lundberg

Instituto de Medicina Molecular de Finlandia (FIMM), Universidad de Helsinki, Helsinki, Finlandia

Pedro Horvath

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Conceptualización: AMFC, PH y MM; Metodología: AM, FC, ADB, MB, BDA y MM; Software: RH, FK, AK y PH; Investigación: AM, FC y RH; Análisis formal: AM, FC y RH; Redacción—borrador original: AM, FC, PH y MM; Redacción—revisión y edición: todos los autores; Recursos: todos los autores.; Curación de datos: LMRG, MB, SN, AM, FC, RH, FK, AK, AS, EM, LS, MAE, E. Lengyel y PH; Visualización: AM, FC, AS y RH; Administración de proyectos: AM y PH; Supervisión: MM; Adquisición de fondos: FC, PH, E. Lundberg y MM

Correspondencia a Andreas Mund, Peter Horvath o Matthias Mann.

PH es el fundador y accionista de Single-Cell Technologies Ltd., una empresa de análisis de biodatos que posee y desarrolla el software BIAS. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Biotechnology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Cuerpo celular y segmentación de núcleos de melanoma, glándulas salivales y tejido de las trompas de Falopio utilizando el software de análisis de imágenes biológicas (BIAS). Evaluamos la precisión de nuestro enfoque de segmentación utilizando la métrica F1 y comparamos los resultados con tres métodos adicionales M1-M3. unet4nuclei (M1)6, CellProfiler (M2)8, CellPose (M3)7, mientras que OUR se refiere a nucleAIzer3. Las barras muestran puntuaciones F1 medias con SEM (error estándar de la media). Representación visual de los resultados de la segmentación: las áreas verdes corresponden a verdaderos positivos, las azules a falsos positivos y las rojas a falsos negativos. Datos proporcionados en la Tabla 1 y la Tabla complementaria 1. b, BIAS permite el procesamiento de múltiples formatos de archivo de imagen de microscopía 2D y 3D. Ejemplos de preprocesamiento de imágenes, segmentación de imágenes basada en aprendizaje profundo, extracción de características y clasificación de fenotipos basada en aprendizaje automático. c, Izquierda: Alineación del contorno en el software LMD7 antes de la microdisección con láser de las células epiteliales de las trompas de Falopio. Medio: Captura de pantalla después de la microdisección láser. Derecha: inspección de 384 pozos después de la microdisección con láser en células epiteliales individuales de las trompas de Falopio. d, Número de proteínas cuantificadas por réplica de células epiteliales positivas y negativas para FOXJ1. Las muestras se adquirieron en modo independiente de los datos y se analizaron con el software DIA-NN. e, replicar las correlaciones de las mediciones del proteoma. Los valores de correlación muestran correlaciones de Pearson. f, Análisis de enriquecimiento de ruta para proteínas significativamente mayor en células ciliadas en comparación con células epiteliales secretoras de las trompas de Falopio.

a, Resultados proteómicos cuantitativos de réplicas de células completas y núcleos, y comparación entre células completas y núcleos. b, Análisis de componentes principales (PCA) de proteomas de células completas (n = 3) y núcleos (n = 3). Se destacan las proteínas con la mayor contribución a PC1. c, Proporciones relativas de las seis clases de núcleos. d, Número de proteínas expresadas diferencialmente (prueba t bilateral, n = 3 réplicas biológicas) en comparación con núcleos no clasificados (a granel). Las proteínas con un FDR inferior a 0,05 se consideraron significativas. e, Correlación entre el número de proteínas reguladas significativamente por clase de núcleo frente a la proporción de clase relativa. Se ajustó un modelo lineal a los datos que mostraba una correlación inversa con Pearson r = -0,96 (valor p = 0,01). f, niveles de proteína relativos (puntuación z) de marcadores de ciclo celular conocidos en las cinco clases de núcleos. Todos los gráficos de barras representan la media de los datos (n = 3 réplicas biológicas) y se muestran las barras de error con los valores p de ANOVA sd.

a, Gráficos de violín que muestran el área nuclear en píxeles de las 6 clases de núcleos identificadas por ML. b, Área nuclear en píxeles de células U2OS FUCCI en relación con el pseudotiempo del ciclo celular14. El código de color indica la densidad de puntos. c, Área nuclear de los tres estados principales del ciclo celular G1, G1/S y S/G2 determinada por intensidades de CDT1 y GMNN marcadas con fluorescencia y agrupamiento gaussiano. Los diagramas de caja muestran los resultados de n = 238 675 celdas en total (85 551 para G1, 83 121 para G1/S y 70 003 para S/G2). d, niveles de proteína relativos de todas las proteínas ORF identificadas en el conjunto de datos. C7orf50, C1orf112, C19orf53 y C11orf98 se expresaron diferencialmente (valor de p de ANOVA < 0,05) en las 5 clases de núcleos (n = 3 réplicas biológicas). e, Intensidades medias de C7orf50 teñido con inmunofluorescencia y los marcadores del ciclo celular ANLN y CCNB1 en células U20S. Los niveles de C7orf50 se cuantificaron en núcleos con intensidades bajas y altas de ANLN y CNNB1. Los diagramas de caja muestran los resultados de n = 263 celdas por condición (C7orf50-ANLN) y n = 412 por condición (C7orf50-CCNB1). f, Panel superior: Imágenes representativas de inmunofluorescencia de células U2OS teñidas con C7orf50 y ADN (DAPI)19. La barra de escala es de 20 µm. Tenga en cuenta que C7orf50 está enriquecido en nucleolos. Panel inferior: inmunohistoquímica de un adenocarcinoma pancreático teñido con C7orf50 (https://bit.ly/2X4re05). Crédito de la imagen: Atlas de proteínas humanas. La barra de escala es de 40 µm. g, análisis de supervivencia de Kaplan-Meier del adenocarcinoma pancreático (https://bit.ly/3BAxewA) basado en niveles relativos de ARN C7orf50 (FPKM, número de fragmentos por kilobase de exón por millón de lecturas). Los datos de RNA-seq se informan como FPKM medianos, generados por The Cancer Genome Atlas (https://bit.ly/3iSOG8d). Los pacientes se dividieron en dos grupos según los niveles de C7orf50 con n=41 pacientes bajos y n=135 pacientes altos. Se calculó una prueba de rango logarítmico con p = 0,0001. h, análisis de interactoma de cuerdas para C7orf50. Se utilizó una puntuación de confianza alta de 0,7 con los cinco interactuadores más cercanos resaltados por color54. Los diagramas de caja en c y e definen el rango de los datos (bigotes), los percentiles 25 y 75 (caja) y las medianas (línea continua). Los valores atípicos se trazan como puntos individuales fuera de los bigotes.

a, Tinción inmunohistoquímica de glándula salival normal teñida para la proteína de adhesión celular EpCAM. El ML supervisado (bosque aleatorio) fue entrenado para identificar células acinares (verde) y ductales (turquesa). Barra de escala = 20 µm. b, Comparación proteómica cuantitativa entre células acinares y ductales del tejido en A con marcadores específicos de tipos de células conocidos resaltados (https://bit.ly/3iOK8Qf). c, Niveles de proteína relativos de vías seleccionadas que fueron significativamente más altos en células acinares o de conducto. d, agrupación jerárquica no supervisada de proteomas de células acinares y de conductos de dos pacientes diferentes junto con células de carcinoma de células acinares. Tenga en cuenta que las células acinares normales de dos tejidos diferentes se agruparon. Las células del conducto se agruparon más lejos. Antes del agrupamiento, se promediaron los niveles de proteína de diferentes grupos de muestras (tejido de células del conducto n.º 1, tejido de células acinares n.º 1, tejido de células acinares n.º 2, tejido de carcinoma n.º 2) y puntuación z. La barra de la izquierda muestra vías expresadas diferencialmente del panel b con acinos y proteínas específicas de conducto en verde y turquesa, respectivamente.

a, Aislamiento de melanocitos positivos para SOX10 adyacentes al tumor de un tejido de melanoma cutáneo. Izquierda: alineación del contorno antes de la microdisección láser. Derecha: Inspección después de la microdisección láser. b, Número de cuantificaciones de proteínas por tipo de muestra con n = 4 (melanocitos), n = 5 (estroma), n = 5 (melanoma in situ) y n = 13 (melanoma) réplicas independientes. Los gráficos de barras representan la media de los datos y las barras de error son sd. Las muestras se adquirieron en modo independiente de los datos y se analizaron con el software DIA-NN. c, panel superior: mapa de calor de la Fig. 5h que se muestra con grupos de proteínas identificados (barra de color). Agrupación jerárquica no supervisada basada en los 1910 grupos de proteínas significativos de ANOVA (FDR < 0,05). Los niveles de proteína se puntuaron en z. Panel inferior: análisis de enriquecimiento de rutas de diferentes grupos de filas obtenidos mediante agrupamiento jerárquico no supervisado. El paquete ReactomePA se utilizó para el análisis de enriquecimiento con un límite de FDR de 0,05 para todos los términos enriquecidos. d, Niveles relativos (puntuación z) de proteínas relacionadas con el término KEGG 'melanogénesis'. Tenga en cuenta que los melanocitos muestran los niveles más altos de proteína. Los diagramas de caja definen el rango de los datos (bigotes), los percentiles 25 y 75 (caja) y las medianas (línea continua). Los valores atípicos se trazan como puntos individuales fuera de los bigotes. e, Análisis de enriquecimiento de vías de proteínas reguladas hacia arriba o hacia abajo en células de melanoma de crecimiento vertical versus radial. Los resultados del enriquecimiento se obtuvieron con el paquete ClusterProfiler R36 basado en un FDR < 0,05.

información de sesgo

Aislamiento de núcleo único LMD automatizado

Aislamiento unicelular LMD automatizado

Precisión comparativa del enfoque de segmentación utilizando la métrica F1 y comparación de resultados con tres métodos adicionales

Análisis de enriquecimiento de la vía para proteínas significativamente más alto en las células ciliadas en comparación con las células epiteliales secretoras de las trompas de Falopio basado en una prueba exacta de Fisher con un FDR de Benjamini-Hochberg < 0,05

Resultados del análisis de enriquecimiento de la vía para proteínas reguladas diferencialmente entre clases de núcleos basados ​​en la prueba exacta de Fisher con un FDR de Benjamini-Hochberg < 0,05

Proteínas reguladas diferencialmente a través de clases de núcleo basadas en análisis ANOVA con un FDR basado en permutación < 0.05

Resultados del análisis de enriquecimiento de vías para proteínas reguladas diferencialmente entre células acinares y de conductos de la glándula salival sana según una prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney de dos caras (dos muestras) con un FDR de Benjamini-Hochberg < 0,05

Proteínas reguladas diferencialmente entre el carcinoma de células acinares y las células acinares normales. Se realizó una prueba t de dos caras con un FDR basado en permutación < 0.05

Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de Reactome Pathways (ReactomePA) para melanoma in situ versus melanoma primario. Se muestran vías con un valor P ajustado por FDR de <0,05

Proteínas reguladas diferencialmente entre todas las clases de células del melanoma primario según el análisis ANOVA con un FDR basado en permutación < 0,05

Resultados del análisis de enriquecimiento de la ruta para proteínas en los dos grupos de mapas de calor resaltados de la Fig. 5i basados ​​en una prueba exacta de Fisher con un FDR de Benjamini-Hochberg <0.05

Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de Reactome Pathways (ReactomePA) para células de melanoma de la fase de crecimiento vertical versus radial. Se muestran vías con un valor P ajustado por FDR de <0,05

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Reimpresiones y permisos

Mund, A., Coscia, F., Kriston, A. et al. La Proteómica Visual Profunda define la identidad y la heterogeneidad de una sola célula. Nat Biotechnol 40, 1231–1240 (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01302-5

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Recibido: 08 marzo 2022

Aceptado: 30 de marzo de 2022

Publicado: 19 mayo 2022

Fecha de emisión: agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-022-01302-5

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